Una gran herramienta para investigar la contribución de los ligandos y/o del medio ambiente a la estabilidad de las proteínas está representada por el ensayo de desnaturalización UV por radiación sincrotrón, que consiste en la adquisición de un número de espectros SRCD ultravioleta repetidos y consecutivos.

No hace mucho tiempo demostramos que el mecanismo predominante de esta desnaturalización implica la tecnología de radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS). En este trabajo, analizamos el impacto de los agentes amortiguadores generalmente utilizados en las mediciones espectroscópicas, junto con el MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanesulfónico), el HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-sulfónico), el TRIS-HCl (clorhidrato de tris-hidroximetano) y el fosfato, en la eficacia de la desnaturalización de proteínas provocada por la publicidad de la radiación UV.

Los experimentos de fluorescencia confirmaron la presencia de ROS y se utilizaron para averiguar la velocidad de la tecnología ROS. Nuestros resultados indican que la eficacia del proceso de desnaturalización está fuertemente influenciada por la composición del tampón, con MOPS y HEPES actuando además como secuestradores, y que la presencia de proteínas influye en la carga de formación de ROS.

Uso de la cromatografía de cambio de tampón de afinidad en tándem en línea con la espectrometría de masas nativa para optimizar la sobreexpresión y la purificación de proteínas recombinantes

La purificación de proteínas recombinantes suele conllevar la sobreexpresión en programas heterólogos y el posterior aislamiento mediante cromatografía. Mientras que la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida desnaturalizante se utiliza habitualmente para mostrar una amplia gama de circunstancias de sobreexpresión (por ejemplo, el huésped, el medio, el foco inductor, la temperatura posterior a la inducción y/o el tiempo de incubación) y para evaluar la pureza del producto final, sus limitaciones, junto con la migración aberrante de la proteína atribuible a las excentricidades de composición o a la desnaturalización incompleta, suelen impedir las conclusiones de la agencia relacionadas con el grado de sobreexpresión y/o purificación.

Debido a este hecho, hemos informado recientemente de una técnica automática basada en la cromatografía líquida-espectrometría de masas que {acopla} la cromatografía de afinidad de acero inmovilizado (IMAC) con el cambio de tampón en línea basado en la exclusión de la medición (OBE) y la espectrometría de masas nativa (nMS) para analizar inmediatamente los lisados celulares para la presencia de proteínas objetivo.

IMAC-OBE-nMS puede utilizarse para evaluar si las proteínas objetivo (1) están sobreexpresadas en tipo soluble, (2) se unen y eluyen de una resina IMAC, (3) se oligomerizan, y (4) tienen la masa prevista. Aquí utilizamos 4 proteínas etiquetadas con poli-His para mostrar el potencial de IMAC-OBE-nMS para la optimización rápida de las circunstancias de sobreexpresión y purificación para la fabricación de proteínas recombinantes.
Los tampones de transporte de iones compensatorios día a día los ritmos de proteínas para controlar la estabilidad osmótica y la fisiología móvil
Entre el 6 y el 20% del proteoma móvil está bajo la gestión circadiana y sintoniza el rendimiento de las células de mamífero con los ciclos ambientales diarios. Para la viabilidad de la célula, y para cuidar la cantidad dentro de los límites delgados, la variación diaria en el potencial osmótico ejercida por los ajustes dentro del proteoma soluble tiene que ser contrarrestada.

Los mecanismos y las penalidades de esta compensación osmótica no han sido investigados antes. En las células cultivadas y en el tejido descubrimos que la compensación implica el transporte energético electroneutral de Na+, Ok+ y Cl- por medio del ejercicio diferencial de los cotransportadores de la familia SLC12A.

En los cardiomiocitos ex vivo e in vivo, los flujos de iones compensatorios confieren una variación diaria en el ejercicio eléctrico. La alteración de la abundancia de proteínas solubles tiene resultados proporcionales en la composición de iones y el rendimiento móvil a lo largo del ciclo circadiano. Por lo tanto, la regulación circadiana del proteoma afecta a la homeostasis de los iones con consecuencias importantes para la fisiología de las células con energía eléctrica, como los cardiomiocitos.

Impacto de un buen tampón en el destino de gotas metaestables ricas en proteínas cercanas a la composición fisiológica

Las microgotas metaestables ricas en proteínas se producen a partir de la separación líquido-líquido (LLPS) de opciones acuosas de proteínas. Estos glóbulos serán intermediarios para la formación de diferentes fases ricas en proteínas. Las opciones acuosas de lisozima llevan LLPS alrededor de 0 °C en presencia de NaCl cerca de las circunstancias fisiológicas.

Aquí, se demuestra que la inserción de pequeñas cantidades de 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonate (HEPES, 0,1 M) como un segundo aditivo a la lisozima-NaCl-opciones de agua cerca de la energía iónica fisiológica (0,2 M) es un paso vital para desencadenar la conversión de las gotitas ricas en proteínas en una otra parte. En particular, el LLPS inducido por el enfriamiento da lugar de forma reproducible a una formación rápida y de alto rendimiento de micropartículas cristalinas tetragonales compactas únicamente en presencia de HEPES.

Estos microcristales presentan una medida pequeña (1-Tres μm), una distribución de medida delgada y propiedades de unión a huéspedes. El diagrama de la parte de la temperatura-concentración revela una topología de atributos con LLPS límite metaestable con respecto a los microcristales tetragonales, que en el flip se convierten en mucho menos estable que los cristales ortorrómbicos en forma de varilla por encima de 40 ° C.

Curiosamente, la dispersión dinámica suave, las valoraciones de iones de hidrógeno y la calorimetría de valoración isotérmica revelan que las interacciones lisozima-HEPES han sido descubiertas como débilmente atractivas y exotérmicas. Nuestros hallazgos señalan que los componentes del tipo de salación pueden significar una cuestión vital que controla el destino de las microgotas metaestables ricas en proteínas relacionadas con las formulaciones de fármacos, la cristalografía de femtosegundo y las posibles implicaciones en la compartimentación citoplasmática impulsada por las proteínas.

Las proteínas 14-3-3 amortiguan los receptores sensores de calcio intracelulares para limitar la señalización.
Los receptores de detección de calcio (CaSR) trabajan junto con las proteínas de unión 14-3-3 en un motivo rico en arginina terminal carboxilo. Las mutaciones reconocidas en pacientes con hipercalcemia familiar hipocalciúrica, hipocalcemia autosómica dominante, pancreatitis o epilepsia idiopática contribuyen a la importancia de este motivo. Mezclamos la microscopía de fluorescencia de reflexión interna completa y los enfoques bioquímicos para averiguar el mecanismo de regulación de la proteína 14-3-Three de la señalización del CaSR.

La falta de unión de 14-3-Three desencadenó una elevada señalización basal de CaSR y rangos de la membrana plasmática, y un aumento considerablemente mayor de los receptores de la membrana plasmática provocado por la señalización. El bloqueo de la glicosilación del núcleo con tunicamicina demostró que los ajustes en los rangos de CaSR de la membrana plasmática habían sido atribuibles a las variaciones en la carga exocítica.

Western blot para cuantificar los ajustes dependientes del tiempo en la maduración de CaSR wt expresado y un mutante defectuoso de unión a la proteína 14-3-Three demostró que la señalización aumentará la síntesis para cuidar de los rangos fijos de las variedades inmaduras y maduras glicosiladas. CaSR por lo tanto opera por un mecanismo de alimentación hacia adelante, por lo que la señalización no sólo induce el tráfico anterógrado de los receptores nacientes, pero, además, aumentará la biosíntesis para cuidar de los rangos de estado regular de la web móvil CaSR.

En general, estas investigaciones recomiendan que 14-3-Three vinculante en el extremo carboxilo da un mecanismo de amortiguación vital para ampliar la piscina intracelular de CaSR por ahí para el tráfico de señalización evocada, sin embargo, atenúa el tráfico para gestionar la variación dinámica de las respuestas al calcio extracelular.
Inactivación de virus utilizando nuevos tampones de lavado de proteína A.
La inactivación viral a bajo pH se lleva a cabo a menudo en el pool de eluidos que sigue al paso de incautación de la proteína A durante la fabricación de anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión Fc. Sin embargo, la publicidad a bajo pH tiene el potencial de cambiar la calidad de la proteína. Para evitar estas dificultades, se han desarrollado nuevos tampones de lavado capaces de inactivar los virus mientras que los anticuerpos o las proteínas de fusión Fc se han unido a la proteína A o a las resinas de modo mixto.

Al equilibrar la columna en un tampón salino excesivo (sulfato de amonio 2 M o cloruro de sodio 3 M) después de la carga, las interacciones hidrofóbicas entre los anticuerpos y los ligandos de la proteína A se habían elevado lo suficiente como para detener la elución a pH 3. Además, se descubrió que el sulfato de amonio desencadenaba la unión de un anticuerpo a una resina de cambio catiónico de modo mixto y a una resina de cambio aniónico de modo mixto a valores de pH que desencadenaban la elución en resinas de cambio catiónico y aniónico estándar (pH 3,5 para Capto Adhere y pH 8,Zero para Capto MMC), lo que indicaba que la retención era atribuible a interacciones hidrofóbicas mejoradas.

Se ha estudiado el potencial del tampón de pH tres de sulfato de amonio de dos M, un tampón de arginina de 1 M y un tampón que contiene el detergente LDAO para inactivar el virus XMuLV cuando se utilizan como tampones de lavado de proteína A con un tiempo de contacto de 1 hora. Los tampones de lavado con exceso de sal y detergente proporcionaron unos 5 logs de eliminación, decididos mediante PCR, y una eliminación e inactivación mixta completa >> 6 logs), decidida mediante la medición de la infectividad. Los nuevos lavados con proteína A podrían presentar pasos de inactivación viral extra rápidos y automatizados con conductividades de piscina reducidas.