La determinación de los autoantígenos de los autoanticuerpos serológicos requiere estrategias costosas, como los microarrays de proteínas o la IP+MS. Por lo tanto, los sueros suelen ser preseleccionados para detectar patrones inmunológicos llamativos por medio de la inmunocitoquímica/inmunohistoquímica. Sin embargo, distinguir los patrones inmunológicos podría ser problemático y los antígenos intracelulares son mucho menos accesibles. Por lo tanto, se introduce un cribado por inmunoblot fácil y de bajo coste que permite distinguir los inmunopatrones y detectar las proteínas refractarias.

Se revisan 5 pasos del cribado de autoantígenos basado en inmunoblotting: (1) alternativa de suministro de proteínas, (2) extracción de proteínas, (3) separación de proteínas, (4) cambio de proteínas, (5) detección de antígenos. A partir de entonces, se han examinado los sueros de 52 pacientes con polineuropatía desmielinizante inflamatoria persistente (CIDP) y 45 controles. Los pasos 2 a 4 podrían adaptarse a las proteínas refractarias. Además, el corte longitudinal de los carriles de proteínas ahorra ≥75% de tiempo y materiales y permite una comparación precisa de los patrones de bandas. Dado que estos últimos son individuales y se fijan rápidamente, los denominamos “huellas dactilares inmunológicas”.

En una prueba de principio, se detectó una inmunobanda de 155 kDa con dos sueros de CIDP antineurofascina-155 positivos y dos inmunobandas adicionales (120/220 kDa) particulares de un subgrupo de 3-6 de 52 enfermos de CIDP.Tailored immunoblotting es una metodología asequible y fácil para el cribado correcto de suero junto con antígenos refractarios e intracelulares.

Inmunoblotting cuantitativo de cepas celulares como costumbre para validar la inmunofluorescencia para la cuantificación de proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina.4
La cuantificación de proteínas de interés en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) es necesaria para fines médicos y de análisis. Una metodología óptima de cuantificación es correcta, tiene una amplia variación dinámica lineal y mantiene la integridad estructural del patrón para permitir la identificación de tipos de células particulares. Las estrategias actuales, como la inmunohistoquímica (IHC), la espectrometría de masas y la inmunotransferencia, no cumplen estos requisitos debido a su naturaleza categórica o a la necesidad de homogeneizar el patrón.

Como metodología sustitutiva, sugerimos el uso de la inmunofluorescencia (IF) y la evaluación de imágenes para averiguar la abundancia relativa de una proteína de interés en los tejidos FFPE. Aquí mostramos que esta metodología está bien optimizada, produce una gran variedad dinámica, y es linealmente cuantificable en comparación con el lugar común de oro de la inmunotransferencia cuantitativa.

Además, esta metodología permite el mantenimiento de la integridad estructural del patrón y permite la excelencia de los tipos de células variadas, lo que puede ser esencial en los propósitos de diagnóstico. En definitiva, se trata de una metodología sólida para la cuantificación relativa de proteínas en muestras FFPE y puede adaptarse fácilmente a las necesidades médicas o de análisis.

Procedimientos de inmunotransferencia e inmunolocalización para microscopía electrónica de transmisión durante la formación de nódulos organogénicos en lúpulo.

La inmunolocalización para microscopía electrónica de transmisión es un enfoque robusto para determinar la localización subcelular de las proteínas. Esto se puede mezclar con el conocimiento molecular y fisiológico en un esfuerzo por tener una visión completa del desempeño de las proteínas. No obstante, se requiere una conservación óptima de los patrones para evitar los artefactos. Cuando se utilizan muestras montadas químicamente, el enfoque de disminución progresiva de la temperatura (PLT) es un proceso práctico para deshidratar e incrustar las muestras a baja temperatura, preservando así la antigenicidad de las proteínas a detectar.

A pesar de algunas grandes ventajas del etiquetado con inmunogold, es un enfoque de biología celular que requiere mucho tiempo. En consecuencia, la norma y la especificidad del anticuerpo deben comprobarse previamente mediante western blot. Este método permite, además, determinar las modificaciones en la cantidad de proteína que se examina a lo largo del crecimiento o en respuesta a situaciones de estrés.

Un sencillo proceso de enriquecimiento mejora la detección de proteínas de membrana por inmunotransferencia.
Hemos desarrollado un método novedoso para mejorar la detección de proteínas asociadas a la membrana en lisados de células de levadura mediante inmunotransferencia. Nuestra metodología consiste en un proceso de enriquecimiento sencillo que utiliza la sedimentación para eliminar las proteínas solubles y el uso de un tampón de electroforesis alternativo, que permite la solubilización de las proteínas sin necesidad de calentamiento. La eficacia de este método se demostró para las proteínas de membrana de Hansenula polymorpha (Pho87, Gas1 y Pmr1) y Saccharomyces cerevisiae (Gas1).

La evaluación por inmunoblot de las proteínas que no están asociadas a la membrana confirmó que la fracción precipitada estaba desprovista de Sup45, carboxipeptidasa Y y Hog1; sin embargo, la tubulina y, en cierta medida, Sup35 y Tpd3 se precipitaron junto con las proteínas de membrana. La presencia de tubulina en la misma fracción que las proteínas de membrana permite su uso como proteína de referencia.
El doble blot: una respuesta al problema de la unión inespecífica de los anticuerpos secundarios en los procedimientos de inmunotransferencia.
Las interacciones inespecíficas entre las proteínas secadas y los anticuerpos secundarios no relacionados generan falsos positivos en los métodos de inmunoblotting. Se han desarrollado algunos procedimientos para reducir esta adsorción, pero pueden funcionar en determinados casos y ser ineficaces en otros. Para superar este inconveniente se ha desarrollado el “double-blotting”. Consiste en interpolar un segundo paso de blotting entre los sondeos estándar de la membrana del blot con el primer anticuerpo y los anticuerpos secundarios.

Este paso, al aislar el primer anticuerpo de las proteínas interferentes, garantiza la especificidad del sondeo con el anticuerpo secundario. Esta metodología se ha desarrollado para el examen de la eritropoyetina en la orina concentrada, ya que se observa una potente unión inespecífica de los anticuerpos secundarios biotinilados a algunas proteínas urinarias utilizando los protocolos clásicos de inmunotransferencia.

No obstante, su idea la hace utilizable en diferentes propósitos que se enfrentan a este tipo de inconveniente. Se prevé que esta metodología sea especialmente útil para investigar las proteínas que pueden estar presentes en cantidades mínimas en medios orgánicos complicados.

Crecimiento de los métodos de inmunoblotting para la detección de radicales del ADN.

Los daños radicales en el ADN se han relacionado con la muerte de las células, la disfunción móvil y la mayoría de los cánceres. Un método desarrollado recientemente para detectar los radicales del ADN utiliza el señuelo de espín de nitrona DMPO (5,5-dimetil-1-pirrolina N-óxido) para atraer a los radicales. Los radicales atrapados se descomponen en aductos de nitrona estables, detectables con anticuerpos anti-DMPO y cuantificables mediante ELISA o ensayo de manchas. No obstante, es más probable que las secuencias de ADN que se pueden romper sean tan necesarias como el grado de daño global.

Posteriormente, hemos desarrollado estrategias de inmunotransferencia para la detección de aductos de nitrona del ADN en el ADN separado electroforéticamente, de forma similar a la inmunotransferencia para las proteínas. Estos nuevos métodos no sólo permiten la evaluación de los rangos relativos de aductos radicales, sino que pueden revelar fragmentos particulares de ADN, y finalmente nucleótidos, como objetivos radicales.

Fuentes :

1. Gentaur
2. NCBI